Tamponul de liză

Tu: Tamponul de liză este responsabil pentru denaturarea proteinelor și ajută la descompunerea țesuturilor și a celulelor.

Dr. Dumitrescu: Foarte bine! Așa este corect. Îți amintești ce conține pentru a face asta?

Tu: Tamponul de liză nu conține detergenți?

Dr. Dumitrescu: Așa este, detergenții ajută la ruperea celulelor și a țesuturilor, eliberând conținutul lor, inclusiv ADN-ul. De asemenea, ajută la denaturarea proteinelor, făcându-le mai accesibile digestiei de către Proteinaza K. Amintește-ți că în prima parte a procesului de izolare a ADN-ului, proteinaza K este adăugată la tamponul de liză (ATL).

(Enzima Proteinază K digeră proteinele, inclusiv nucleazele care ar putea degrada ADN-ul, și ajută la lizarea celulelor și a țesuturilor. Aceasta asigură că ADN-ul este eliberat din complexele proteină-ADN și rămâne intact în timpul procesului de purificare.)

Tu: A fost foarte util, Dr. Dumitrescu. Prin înțelegerea scopului fiecărui reactiv, pot aprecia acum mai bine modul în care funcționează procesul de purificare a ADN-ului. Înțeleg că este nevoie de ADN de înaltă calitate pentru PCR. Voi merge mai departe și voi izola ADN din cozi de șoarece.

Dr. Dumitrescu: Mult succes cu prima ta izolare de ADN.

Rolul celorlalți reactivi poate fi adăugat ca informații suplimentare, după cum urmează:

Tampon AL/Etanol: Tamponul AL conține săruri chaotrope, care ajută la lizarea celulelor și la denaturarea proteinelor și a acizilor nucleici. De asemenea, ajută la legarea ADN-ului de membrana de silica din coloana de centrifugare prin perturbarea legăturilor de hidrogen și a interacțiunilor hidrofobe. Etanolul este folosit pentru a precipita ADN-ul și a-i îmbunătăți legarea de membrana de silica din coloana de centrifugare. Ajută la eliminarea contaminanților și facilitează etapele de spălare prin faptul că face ADN-ul mai puțin solubil în faza apoasă.

Tampoane de spălare 1 (AW1): Coloana care conține proba este spălată cu Tamponul AW1. Acest tampon de spălare conține o concentrație scăzută de săruri chaotrope și etanol. Ajută la eliminarea proteinelor, a sărurilor și a altor contaminanți din ADN-ul legat de membrana de silica fără a elua ADN-ul.

Tampon de spălare 2 (AW2): Coloana care conține proba este spălată cu Tamponul AW2. Acest tampon de spălare conține etanol, dar nu și săruri chaotrope. Curăță în continuare ADN-ul prin eliminarea oricăror contaminanți rămași, cum ar fi sărurile și proteinele reziduale, asigurând că preparatul final de ADN este pur.

Tampon AE (sau apă distilată): Acest tampon de eluție este folosit pentru a elibera ADN-ul purificat de pe membrana de silica. Tamponul AE conține de obicei Tris-EDTA, care ajută la stabilizarea ADN-ului și la protejarea acestuia de degradare. Apa distilată poate fi, de asemenea, utilizată dacă se dorește o eluție mai neutră.