Muestra de área más grande y cuando se necesita información sobre la superficie

Prof. Maceda: Correcto, usamos SEM cuando necesitamos información de superficie y no de la estructura interna. TEM sería ideal para visualizar componentes de la membrana celular, orgánulos, proteínas y fibras del citoesqueleto. Además, no podemos visualizar especímenes vivos con SEM ni con TEM. Esto se debe a que las muestras para TEM se fijan con colorantes de metales pesados y las muestras para SEM se recubren con iones de oro o paladio.

Tú: ¿Cómo preparamos los portaobjetos para un ME? ¿Es el mismo proceso que el que seguimos con el microscopio óptico?

Prof. Maceda: En realidad, el proceso es mucho más largo y complejo. Vamos a describir las partes principales.

1. Fijación: En primer lugar, se debe conservar el tejido biológico o las células en su estado actual. Para ello, normalmente se utilizan fijadores químicos - a menudo glutaraldehído - seguidos de una fijación posterior con tetróxido de osmio para estabilizar las estructuras celulares.

2. Deshidratación: A continuación, se elimina el agua de la muestra mediante una serie de soluciones de etanol (o acetona) en concentraciones crecientes. Este paso previene la distorsión o el colapso de las estructuras delicadas al colocar la muestra en el vacío.

3. Inclusión: Tras la deshidratación, se incluye el espécimen en una resina (para TEM) o se coloca sobre un soporte adecuado (para SEM). En TEM, la resina proporciona un medio sólido del que se pueden cortar secciones ultrafinas.

4.Seccionamiento (solo TEM): Con un ultramicrotomo, se producen cortes muy finos, normalmente de unos 70 nm de grosor. Estos cortes se transfieren a rejillas diseñadas para microscopía electrónica.

5.Tinción: Se utilizan metales pesados (por ejemplo, acetato de uranilo, citrato de plomo) para aumentar el contraste y resaltar detalles finos. Estos colorantes se unen a componentes celulares, facilitando su distinción bajo el haz de electrones. Para preparar la rejilla TEM, es importante usar pinzas invertidas para sujetarla con el lado de carbono hacia arriba. Con una micropipeta, se coloca la muestra sobre la rejilla, se espera 60 s y se retira el exceso con papel absorbente. Se repite el proceso con agua pura y se seca el exceso de solución (paso de lavado) y, a continucaión, se repite el paso con el tinte de metales pesados y se seca el tinte. Se guarda la rejilla en una caja para rejillas.

6. Montaje y Recubrimiento (específico de SEM): Si preparas una muestra para SEM, se fija sobre un soporte de aluminio. A menudo se aplica una fina capa de metal conductor - por ejemplo, de oro o paladio - para mejorar la calidad de imagen y evitar la acumulación de carga en el haz de electrones.

7. Visualización: Por último, se introduce la muestra preparada en la cámara de vacío del ME y se ajustan los parámetros del instrumento (energía del haz, tamaño del punto, etc.) para capturar el nivel de aumento y resolución deseados.

Mediante estos pasos, se conservan y mejoran las características de las muestras, lo que garantiza imágenes más precisas y detalladas.