Πείραμα PCR

Αποφασίζετε να παρακολουθήσετε ένα βίντεο για να σας βοηθήσει να οπτικοποιήσετε τον τρόπο εκτέλεσης του πειράματος πριν στήσετε τη δική σας αντίδραση:

Στη συνέχεια, προχωράτε στην εξέταση του απομονωμένου DNA για το διαγονίδιο νοβελτίνης, χρησιμοποιώντας PCR. Χρησιμοποιείτε θετικό έλεγχο για την αντίδραση, ο οποίος είναι DNA που απομονώθηκε από ποντίκι που είχε προηγουμένως διαπιστωθεί ότι φέρει το διαγονίδιο. Για τον αρνητικό σας έλεγχο, χρησιμοποιείτε απιονισμένο νερό, αντί για δείγμα DNA. Το μήκος του πολλαπλασιασμένου δείγματος DNA αναμένεται να είναι 370 ζεύγη βάσεων (bp).

Συνθέτετε το μείγμα αντίδρασης ως εξής:

1. 2,5 μl ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης

2. 5 μl πρότυπο DNA

3. 250 ng εμπρόσθιου και οπίσθιου εκκινητή, αντίστοιχα,

4. 0,5 μl dNTPs (κιτ πολυμεράσης cDNA, Clontech)

5. 0,5 μl πολυμεράση Advantage cDNA (κιτ πολυμεράσης cDNA, Clontech)

Τελικός όγκος αντίδρασης 25 μl με απιονισμένο νερό

Ρυθμίζετε το μηχάνημα PCR στις ακόλουθες συνθήκες:

• Αποδιάταξη: ένας κύκλος στους 95 ^oC για 3 λεπτά, συνδεδεμένος με 35 κύκλους στους 95 ^oC για 1 λεπτό.
• Υβριδισμός εκκινητών: 65 ^oC για 1 λεπτό, 72 ^oC για 1 λεπτό.
• Επιμήκυνση: ακολουθούμενη από τελική επέκταση στους 72 ^oC για 10 λεπτά.