Ρυθμιστικά διαλύματα λύσης

Εσείς: Το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης είναι υπεύθυνο για τη μετουσίωση των πρωτεϊνών και βοηθά στη διάσπαση των ιστών και των κυττάρων.

Δρ. Δημητρίου: Μπράβο! Αυτό είναι σωστό. Θυμάστε τι περιέχει για να γίνει αυτό;

Εσείς: Δεν περιέχει απορρυπαντικά το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης;

Δρ. Δημητρίου: Ακριβώς, τα απορρυπαντικά βοηθούν στο σπάσιμο των κυττάρων και των ιστών, απελευθερώνοντας το περιεχόμενό τους, συμπεριλαμβανομένου του DNA. Βοηθούν επίσης στη μετουσίωση των πρωτεϊνών, καθιστώντας τες πιο προσιτές στην διάσπαση από την πρωτεϊνάση Κ. Θυμηθείτε ότι στο πρώτο μέρος της διαδικασίας απομόνωσης του DNA, η πρωτεϊνάση Κ προστίθεται στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (ATL).

[Το ένζυμο πρωτεϊνάση Κ διασπά τις πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων των νουκλεασών που θα μπορούσαν να αποικοδομήσουν το DNA, και βοηθά στην καταστροφή των κυττάρων και των ιστών. Εξασφαλίζει ότι το DNA απελευθερώνεται από τα σύμπλοκα πρωτεΐνης-DNA και παραμένει άθικτο κατά τη διαδικασία καθαρισμού.]

Εσείς: Αυτό ήταν πολύ χρήσιμο Δρ. Δημητρίου. Κατανοώντας τον σκοπό κάθε αντιδραστηρίου, μπορώ τώρα να εκτιμήσω καλύτερα τον τρόπο με τον οποίο λειτουργεί η διαδικασία καθαρισμού του DNA. Καταλαβαίνω ότι απαιτείται υψηλής ποιότητας DNA για την PCR. Θα συνεχίσω με την απομόνωση του DNA από τις ουρές ποντικιών.

Δρ. Δημητρίου: Καλή τύχη με την πρώτη σας απομόνωση DNA.

[Ρυθμιστικό διάλυμα AL/αιθανόλη: Το ρυθμιστικό διάλυμα AL περιέχει χαοτροπικά άλατα, τα οποία βοηθούν στη λύση των κυττάρων και στη μετουσίωση των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων. Βοηθά επίσης στη σύνδεση του DNA με τη μεμβράνη πυριτίου στη στήλη φυγοκέντρησης διασπώντας τους δεσμούς υδρογόνου και τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Η αιθανόλη χρησιμοποιείται για την κατακρήμνιση του DNA και την ενίσχυση της πρόσδεσής του στη μεμβράνη πυριτίου στη στήλη φυγοκέντρησης. Βοηθά στην απομάκρυνση των προσμίξεων και διευκολύνει τα στάδια πλύσης καθιστώντας το DNA λιγότερο διαλυτό στην υδατική φάση.

Ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης 1 (AW1): Η στήλη που περιέχει το δείγμα πλένεται με ρυθμιστικό διάλυμα AW1. Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης περιέχει χαμηλή συγκέντρωση χαοτροπικών αλάτων και αιθανόλης. Βοηθά στην απομάκρυνση των πρωτεϊνών, των αλάτων και άλλων προσμίξεων από το DNA που είναι συνδεδεμένο στη μεμβράνη πυριτίου χωρίς να γίνεται έκπλυση του DNA.

Ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης 2 (AW2): Η στήλη που περιέχει το δείγμα πλένεται με ρυθμιστικό διάλυμα AW2. Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης περιέχει αιθανόλη αλλά όχι χαοτροπικά άλατα. Καθαρίζει περαιτέρω το DNA απομακρύνοντας τυχόν εναπομείνασες προσμίξεις, όπως άλατα και υπολείμματα πρωτεϊνών, εξασφαλίζοντας ότι το τελικό DNA είναι καθαρό.

Ρυθμιστικό διάλυμα AE (ή απιονισμένο νερό): Αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης χρησιμοποιείται για την αποδέσμευση του καθαρισμένου DNA από τη μεμβράνη πυριτίου. Το ρυθμιστικό διάλυμα AE περιέχει συνήθως Tris-EDTA, το οποίο συμβάλλει στη σταθεροποίηση του DNA και στην προστασία του από την αλλοίωση. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί απιονισμένο νερό εάν είναι επιθυμητή μια πιο ουδέτερη πλύση.]