Δείγμα μεγαλύτερης επιφάνειας και όταν απαιτούνται πληροφορίες για την επιφάνεια

Καθ. Ιωάννου: Σωστά, χρησιμοποιούμε το SEM όταν χρειαζόμαστε πληροφορίες για την επιφάνεια και όχι για την εσωτερική δομή! Το TEM θα ήταν ιδανικό για την απεικόνιση συστατικών της κυτταρικής μεμβράνης, οργανιδίων, πρωτεϊνών, ινών του κυτταροσκελετού. Επίσης, δεν μπορούμε να παρατηρήσουμε ζωντανά δείγματα με το SEM ή το TEM. Αυτό συμβαίνει επειδή τα δείγματα για TEM σταθεροποιούνται με βαριές μεταλλικές χρωστικές και τα δείγματα για SEM επικαλύπτονται με ιόντα χρυσού ή παλλαδίου.

Εσείς: Πώς προετοιμάζουμε τις διαφάνειες για ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο; Είναι η διαδικασία ίδια με αυτή που ακολουθήσαμε για το φωτονικό μικροσκόπιο;

Καθ. Ιωάννου: Στην πραγματικότητα, η διαδικασία είναι πολύ μεγαλύτερη και πιο περίπλοκη. Ας παρουσιάσουμε τα βασικά μέρη.

1. Σταθεροποίηση (Fixation): Πρώτα, πρέπει να διατηρήσετε τον βιολογικό ιστό ή τα κύτταρα στην τρέχουσα κατάστασή τους. Αυτό συνήθως περιλαμβάνει τη χρήση χημικών σταθεροποιητικών—συχνά γλουταραλδεΰδη—που ακολουθείται από μετασταθεροποίηση με τετροξείδιο του οσμίου για να σταθεροποιηθούν οι κυτταρικές δομές.

2.Αφυδάτωση (Dehydration): Στη συνέχεια, αφαιρείτε το νερό από το δείγμα μέσω μιας σειράς διαλυμάτων αιθανόλης (ή ακετόνης) αυξανόμενης συγκέντρωσης. Αυτό το βήμα αποτρέπει την παραμόρφωση ή κατάρρευση ευαίσθητων δομών μόλις τοποθετήσετε το δείγμα σε κενό.

3. Εγκιβωτισμός (Embedding): Μετά την αφυδάτωση, το δείγμα εγκιβωτίζεται σε ρητίνη (για TEM) ή τοποθετείται σε κατάλληλη βάση (για SEM). Για το TEM, η ρητίνη παρέχει ένα στερεό μέσο μέσα στο οποίο μπορείτε να κόψετε υπερλεπτές τομές.

4. Τομή (Sectioning – μόνο TEM): Χρησιμοποιώντας ένα υπερμικροτόμο, παράγετε πολύ λεπτές τομές—συνήθως περίπου 70 nm πάχος. Αυτές οι τομές μεταφέρονται σε πλέγματα (grids) σχεδιασμένα για ηλεκτρονική μικροσκοπία.

5. Χρώση (Staining): Βαριά μέταλλα (π.χ. οξικός ουρανύλιο, κιτρικός μόλυβδος) χρησιμοποιούνται για να αυξηθεί η αντίθεση και να αναδειχθούν λεπτομέρειες. Αυτές οι χρωστικές δεσμεύονται σε διάφορα κυτταρικά συστατικά, διευκολύνοντας τη διάκρισή τους υπό την δέσμη ηλεκτρονίων. Για την προετοιμασία του grid στο TEM, είναι σημαντικό να χρησιμοποιήσετε τσιμπίδα με ανάποδη λαβή ώστε να κρατάτε το grid με την ανθρακική πλευρά προς τα πάνω. Χρησιμοποιώντας πιπέτα, προσθέστε το δείγμα στο grid, περιμένετε 60 δευτερόλεπτα και χρησιμοποιήστε απορροφητικό χαρτί για να αφαιρέσετε το πλεονάζον διάλυμα. Επαναλάβετε τη διαδικασία με καθαρό νερό και αφαιρέστε το πλεονάζον (βήμα πλυσίματος) και μετά επαναλάβετε το βήμα με τη μεταλλική χρωστική και απομακρύνετε τη χρωστική. Αποθηκεύστε το grid σε κουτί για grids.

6. Τοποθέτηση και Επικάλυψη (Mounting and Coating – ειδικά για SEM): Αν προετοιμάζετε ένα δείγμα για SEM, μπορείτε να το στερεώσετε σε βάση από αλουμίνιο. Συχνά εφαρμόζεται μία λεπτή αγώγιμη μεταλλική επικάλυψη—όπως χρυσός ή παλλάδιο—για να βελτιωθεί η ποιότητα της εικόνας και να αποτραπεί η φόρτιση υπό την δέσμη ηλεκτρονίων.

7. Απεικόνιση (Imaging): Τέλος, τοποθετείτε το προετοιμασμένο δείγμα στον θάλαμο κενού του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου και ρυθμίζετε τις παραμέτρους του οργάνου (π.χ. ενέργεια δέσμης, μέγεθος σημείου) για να καταγράψετε το επιθυμητό επίπεδο μεγέθυνσης και ανάλυσης.

Μέσα από αυτά τα βήματα διατηρούνται και ενισχύονται τα χαρακτηριστικά του δείγματος, εξασφαλίζοντας τις πιο ακριβείς και λεπτομερείς εικόνες.